Javascript je trenutno onemogućen u vašem pregledniku.Kada je javascript onemogućen, neke funkcije ove web stranice neće raditi.
Javier Fidalgo, * Pierre-Antoine Deglesne, * Rodrigo Arroyo, * Lilian Sepúlveda, * Evgeniya Ranneva, Philippe Deprez Odjel za znanost, Skin Tech Pharma Group, Castello D'Empúries, Katalonija, Španjolska * Ovi autori imaju neke uvide u ovaj rad Equal pozadina doprinosa: Hijaluronska kiselina (HA) prirodni je polisaharid koji se koristi u proizvodnji dermalnih punila u estetske svrhe.Budući da ima poluživot od nekoliko dana u ljudskim tkivima, dermalni fileri na bazi HA kemijski su modificirani kako bi im se produžio život u tijelu.Najčešća modifikacija komercijalnih punila na bazi HA je upotreba 1,4-butandiol diglicidil etera (BDDE) kao sredstva za umrežavanje za umrežavanje lanaca HA.Zaostali ili neizreagirani BDDE smatra se netoksičnim pri <2 dijela na milijun (ppm);stoga se rezidualni BDDE u konačnom dermalnom punilu mora kvantificirati kako bi se osigurala sigurnost pacijenata.Materijali i metode: Ova studija opisuje detekciju i karakterizaciju nusproizvoda reakcije umrežavanja između BDDE i HA u alkalnim uvjetima kombinacijom tekućinske kromatografije i masene spektrometrije (LC-MS).Rezultati: Nakon različitih analiza, utvrđeno je da su alkalni uvjeti i visoka temperatura korišteni za dezinfekciju HA-BDDE hidrogela pospješili stvaranje ovog novog nusproizvoda, spoja "sličnog propilen glikolu".LC-MS analiza potvrdila je da nusproizvod ima istu monoizotopnu masu kao BDDE, različito vrijeme zadržavanja (tR) i različit način UV apsorbancije (λ=200 nm).Za razliku od BDDE, uočeno je u LC-MS analizi da pod istim uvjetima mjerenja, ovaj nusproizvod ima veću stopu detekcije na 200 nm.Zaključak: Ovi rezultati pokazuju da nema epoksida u strukturi ovog novog spoja.Rasprava je otvorena za procjenu rizika ovog novog nusproizvoda pronađenog u proizvodnji HA-BDDE hidrogela (HA dermalnog punila) u komercijalne svrhe.Ključne riječi: hijaluronska kiselina, HA dermalni filer, umrežena hijaluronska kiselina, BDDE, LC-MS analiza, BDDE nusproizvod.
Fileri na bazi hijaluronske kiseline (HA) najčešći su i najpopularniji dermalni fileri koji se koriste u kozmetičke svrhe.1 Ovo dermalno punilo je hidrogel, obično se sastoji od >95% vode i 0,5-3% HA, što im daje gelastu strukturu.2 HA je polisaharid i glavna komponenta izvanstaničnog matriksa kralješnjaka.Jedan od sastojaka.Sastoji se od (1,4)-glukuronske kiseline-β (1,3)-N-acetilglukozamina (GlcNAc) ponavljajućih disaharidnih jedinica povezanih glikozidnim vezama.Ovaj disaharidni obrazac je isti u svim organizmima.U usporedbi s nekim punilima na bazi proteina (kao što je kolagen), ovo svojstvo čini HA vrlo biokompatibilnom molekulom.Ova punila mogu pokazati specifičnost sekvence aminokiselina koju imunološki sustav pacijenta može prepoznati.
Kada se koristi kao dermalni filer, glavno ograničenje HA je njegova brza izmjena unutar tkiva zbog prisutnosti specifične obitelji enzima zvanih hijaluronidaza.Do sada je opisano nekoliko kemijskih modifikacija u strukturi HA za povećanje poluživota HA u tkivima.3 Većina ovih modifikacija pokušava smanjiti pristup hijaluronidaze polisaharidnim polimerima umrežavanjem HA lanaca.Stoga, zbog stvaranja mostova i intermolekularnih kovalentnih veza između strukture HA i sredstva za umrežavanje, hidrogel umrežene HA proizvodi više produkata razgradnje antienzima od prirodne HA.4-6
Do sada, kemijska sredstva za umrežavanje koja se koriste za proizvodnju umrežene HA uključuju metakrilamid, 7 hidrazid, 8 karbodiimid, 9 divinil sulfon, 1,4-butandiol diglicidil eter (BDDE) i poli(etilen glikol) diglicidil eter.10,11 BDDE je trenutno najčešće korišteno sredstvo za umrežavanje.Iako je za ove vrste hidrogelova dokazano da su sigurni desetljećima, korištena sredstva za umrežavanje su reaktivni reagensi koji mogu biti citotoksični i, u nekim slučajevima, mutageni.12 Stoga njihov rezidualni sadržaj u konačnom hidrogelu mora biti visok.BDDE se smatra sigurnim kada je rezidualna koncentracija manja od 2 dijela na milijun (ppm).4
Postoji nekoliko metoda za otkrivanje koncentracije niskog ostatka BDDE, stupnja poprečnog povezivanja i položaja supstitucije u HA hidrogelovima, kao što je plinska kromatografija, kromatografija isključenja veličine u kombinaciji s masenom spektrometrijom (MS), metode mjerenja fluorescencije nuklearne magnetske rezonancije (NMR) i Tekućinska kromatografija visokog učinka (HPLC) povezana s nizom dioda.13-17 Ova studija opisuje detekciju i karakterizaciju nusproizvoda u konačnom umreženom HA hidrogelu proizvedenom reakcijom BDDE i HA u alkalnim uvjetima.HPLC i tekućinska kromatografija-masena spektrometrija (LC-MS analiza).Budući da je toksičnost ovog nusproizvoda BDDE nepoznata, preporučujemo da se njegova kvantifikacija rezidua odredi na način sličan metodi koja se obično provodi na BDDE u konačnom proizvodu.
Dobivena natrijeva sol HA (Shiseido Co., Ltd., Tokyo, Japan) ima molekularnu težinu od ~1,368,000 Da (Laurentova metoda) 18 i intrinzičnu viskoznost od 2,20 m3/kg.Za reakciju umrežavanja, BDDE (≥95%) je kupljen od Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, SAD).Fosfatno puferirana fiziološka otopina s pH 7,4 kupljena je od Sigma-Aldrich Company.Sva otapala, acetonitril i voda korišteni u LC-MS analizi kupljeni su od HPLC kvalitete.Mravlja kiselina (98%) se kupuje kao reagens.
Svi eksperimenti su izvedeni na UPLC Acquity sustavu (Waters, Milford, MA, SAD) i spojeni na API 3000 trostruki kvadrupolni maseni spektrometar opremljen elektrosprej ionizacijskim izvorom (AB SCIEX, Framingham, MA, SAD).
Sinteza umreženih HA hidrogelova započela je dodavanjem 198 mg BDDE u 10% (w/w) otopinu natrijevog hijaluronata (NaHA) u prisutnosti 1% lužine (natrijev hidroksid, NaOH).Konačna koncentracija BDDE u reakcijskoj smjesi bila je 9,9 mg/mL (0,049 mM).Zatim je reakcijska smjesa temeljito promiješana i homogenizirana te ostavljena da se nastavi na 45°C 4 sata.19 pH reakcije se održava na ~12.
Nakon toga, reakcijska smjesa je isprana vodom, a konačni HA-BDDE hidrogel je filtriran i razrijeđen s PBS puferom kako bi se postigla koncentracija HA od 10 do 25 mg/mL i konačni pH od 7,4.Kako bi se sterilizirali proizvedeni umreženi hidrogelovi HA, svi ti hidrogelovi se autoklaviraju (120°C 20 minuta).Pročišćeni BDDE-HA hidrogel pohranjen je na 4°C do analize.
Za analizu BDDE prisutnog u umreženom HA proizvodu, uzorak od 240 mg izvagan je i uveden u središnju rupu (Microcon®; Merck Millipore, Billerica, MA, SAD; volumen 0,5 mL) i centrifugiran na 10 000 okretaja u minuti na sobnoj temperaturi 10 minuta.Sakupljeno je i analizirano ukupno 20 µL tekućine za izvlačenje.
Kako bi se analizirao BDDE standard (Sigma-Aldrich Co) u alkalnim uvjetima (1%, 0,1% i 0,01% NaOH), ako su ispunjeni sljedeći uvjeti, tekući uzorak je 1:10, 1:100 ili do 1:1 000 000 Ako je potrebno, koristite MilliQ deioniziranu vodu za analizu.
Za početne materijale upotrijebljene u reakciji umrežavanja (HA 2%, H2O, 1% NaOH i 0,049 mM BDDE), 1 mL svakog uzorka pripremljenog od ovih materijala analiziran je korištenjem istih uvjeta analize.
Kako bi se odredila specifičnost vrhova koji se pojavljuju u ionskoj mapi, 10 µL standardne otopine BDDE od 100 ppb (Sigma-Aldrich Co) dodano je uzorku od 20 µL.U ovom slučaju konačna koncentracija standarda u svakom uzorku je 37 ppb.
Najprije pripremite matičnu otopinu BDDE s koncentracijom od 11 000 mg/L (11 000 ppm) razrjeđivanjem 10 μL standardnog BDDE (Sigma-Aldrich Co) s 990 μL MilliQ vode (gustoća 1,1 g/mL).Koristite ovu otopinu za pripremu otopine BDDE od 110 µg/L (110 ppb) kao srednje standardno razrjeđenje.Zatim upotrijebite srednji BDDE standardni razrjeđivač (110 ppb) za pripremu standardne krivulje razrjeđivanjem međurazrjeđivača nekoliko puta kako biste postigli željenu koncentraciju od 75, 50, 25, 10 i 1 ppb.Kao što je prikazano na slici 1, utvrđeno je da standardna krivulja BDDE od 1,1 do 110 ppb ima dobru linearnost (R2>0,99).Standardna krivulja ponovljena je u četiri neovisna eksperimenta.
Slika 1 BDDE standardna kalibracijska krivulja dobivena LC-MS analizom, u kojoj je uočena dobra korelacija (R2>0,99).
Kratice: BDDE, 1,4-butandiol diglicidil eter;LC-MS, tekućinska kromatografija i masena spektrometrija.
Kako bi se identificirali i kvantificirali BDDE standardi prisutni u umreženom HA i BDDE standardi u osnovnoj otopini, korištena je LC-MS analiza.
Kromatografsko odvajanje postignuto je na LUNA 2,5 µm C18(2)-HST koloni (50×2,0 mm2; Phenomenex, Torrance, CA, SAD) i držano na sobnoj temperaturi (25°C) tijekom analize.Mobilna faza sastoji se od acetonitrila (otapalo A) i vode (otapalo B) koji sadrži 0,1% mravlje kiseline.Mobilna faza je eluirana gradijentnom elucijom.Gradijent je kako slijedi: 0 minuta, 2% A;1 minuta, 2% A;6 minuta, 98% A;7 minuta, 98% A;7,1 minuta, 2% A;10 minuta, 2% A. Vrijeme rada je 10 minuta, a volumen injekcije je 20 µL.Vrijeme zadržavanja BDDE je oko 3,48 minuta (u rasponu od 3,43 do 4,14 minuta na temelju eksperimenata).Mobilna faza je pumpana pri brzini protoka od 0,25 mL/min za LC-MS analizu.
Za analizu BDDE i kvantifikaciju pomoću MS, UPLC sustav (Waters) kombiniran je s trostrukim kvadrupolnim masenim spektrometrom API 3000 (AB SCIEX) opremljenim ionizacijskim izvorom elektrospreja, a analiza se izvodi u modu pozitivnih iona (ESI+).
Prema analizi ionskih fragmenata provedenoj na BDDE, fragment s najvećim intenzitetom utvrđen je kao fragment koji odgovara 129,1 Da (slika 6).Stoga, u višeionskom načinu praćenja (MIM) za kvantificiranje, pretvorba mase (omjer mase i naboja [m/z]) BDDE iznosi 203,3/129,1 Da.Također koristi način potpunog skeniranja (FS) i način rada ionskog skeniranja proizvoda (PIS) za LC-MS analizu.
Kako bi se provjerila specifičnost metode, analiziran je slijepi uzorak (početna mobilna faza).U slijepom uzorku s pretvorbom mase od 203,3/129,1 Da nije otkriven signal.Što se tiče ponovljivosti eksperimenta, analizirano je 10 standardnih injekcija od 55 ppb (u sredini kalibracijske krivulje), što je rezultiralo rezidualnom standardnom devijacijom (RSD) <5% (podaci nisu prikazani).
Preostali sadržaj BDDE kvantificiran je u osam različitih autoklaviranih BDDE umreženih HA hidrogelova, što odgovara četirima neovisnim eksperimentima.Kao što je opisano u odjeljku "Materijali i metode", kvantifikacija se procjenjuje pomoću prosječne vrijednosti regresijske krivulje standardnog razrjeđenja BDDE, koja odgovara jedinstvenom vrhuncu otkrivenom pri prijelazu mase BDDE od 203,3/129,1 Da, uz zadržavanje vrijeme od 3.43 do 4.14 minuta Bez čekanja.Slika 2 prikazuje primjer kromatograma referentnog standarda 10 ppb BDDE.Tablica 1 sažima rezidualni sadržaj BDDE u osam različitih hidrogelova.Raspon vrijednosti je od 1 do 2,46 ppb.Stoga je rezidualna koncentracija BDDE u uzorku prihvatljiva za ljudsku upotrebu (<2 ppm).
Slika 2 Ionski kromatogram 10 ppb BDDE referentnog standarda (Sigma-Aldrich Co), MS (m/z) prijelaz dobiven LC-MS analizom od 203,30/129,10 Da (u pozitivnom MRM modu).
Kratice: BDDE, 1,4-butandiol diglicidil eter;LC-MS, tekućinska kromatografija i masena spektrometrija;MRM, praćenje višestrukih reakcija;MS, masa;m/z, omjer mase i naboja.
Napomena: Uzorci 1-8 su autoklavirani BDDE umreženi HA hidrogelovi.Također se navodi zaostala količina BDDE u hidrogelu i vrhunac vremena zadržavanja BDDE.Konačno, također je prijavljeno postojanje novih vršnih vrijednosti s različitim vremenima zadržavanja.
Kratice: BDDE, 1,4-butandiol diglicidil eter;HA, hijaluronska kiselina;MRM, praćenje višestrukih reakcija;tR, vrijeme zadržavanja;LC-MS, tekućinska kromatografija i masena spektrometrija;RRT, relativno vrijeme zadržavanja.
Iznenađujuće, analiza LC-MS ionskog kromatograma pokazala je da na temelju svih analiziranih uzoraka autoklaviranog umreženog HA hidrogela, postoji dodatni vrh pri kraćem vremenu zadržavanja od 2,73 do 3,29 minuta.Na primjer, Slika 3 prikazuje ionski kromatogram umreženog uzorka HA, gdje se dodatni vrh pojavljuje pri različitom vremenu zadržavanja od približno 2,71 minuta.Nađeno je da opaženo relativno vrijeme zadržavanja (RRT) između novoopaženog pika i pika iz BDDE iznosi 0,79 (Tablica 1).Budući da znamo da se novoopaženi vrh manje zadržava u koloni C18 koja se koristi u LC-MS analizi, novi vrh može odgovarati polarnijem spoju od BDDE.
Slika 3 Ionski kromatogram umreženog uzorka HA hidrogela dobivenog LC-MS (MRM konverzija mase 203,3/129,0 Da).
Kratice: HA, hijaluronska kiselina;LC-MS, tekućinska kromatografija i masena spektrometrija;MRM, praćenje višestrukih reakcija;RRT, relativno vrijeme zadržavanja;tR, vrijeme zadržavanja.
Kako bi se isključila mogućnost da novi uočeni vrhovi mogu biti kontaminanti izvorno prisutni u korištenim sirovinama, te su sirovine također analizirane koristeći istu LC-MS metodu analize.Analizirani početni materijali uključuju vodu, 2% NaHA u vodi, 1% NaOH u vodi i BDDE u istoj koncentraciji korištenoj u reakciji unakrsnog povezivanja.Ionski kromatogram upotrijebljenog početnog materijala nije pokazao nikakav spoj ili vršnu vrijednost, a njegovo retencijsko vrijeme odgovara novom uočenom vrhuncu.Ova činjenica odbacuje ideju da ne samo da početni materijal može sadržavati bilo kakve spojeve ili tvari koje bi mogle ometati postupak analize, već nema ni znakova moguće unakrsne kontaminacije s drugim laboratorijskim proizvodima.Vrijednosti koncentracije dobivene nakon LC-MS analize BDDE i novih vršnih vrijednosti prikazane su u tablici 2 (uzorci 1-4), a ionski kromatogram na slici 4.
Napomena: Uzorci 1-4 odgovaraju sirovinama korištenim za proizvodnju autoklaviranih BDDE umreženih HA hidrogelova.Ovi uzorci nisu autoklavirani.
Kratice: BDDE, 1,4-butandiol diglicidil eter;HA, hijaluronska kiselina;LC-MS, tekućinska kromatografija i masena spektrometrija;MRM, praćenje višestrukih reakcija.
Slika 4 odgovara LC-MS kromatogramu uzorka sirovog materijala korištenog u reakciji umrežavanja HA i BDDE.
Napomena: Sve se to mjeri pri istoj koncentraciji i omjeru koji se koriste za izvođenje reakcije umrežavanja.Brojevi za sirovine analizirane kromatogramom odgovaraju: (1) vodi, (2) 2% vodenoj otopini HA, (3) 1% vodenoj otopini NaOH.LC-MS analiza je provedena za konverziju mase od 203,30/129,10 Da (u pozitivnom MRM modu).
Kratice: BDDE, 1,4-butandiol diglicidil eter;HA, hijaluronska kiselina;LC-MS, tekućinska kromatografija i masena spektrometrija;MRM, praćenje višestrukih reakcija.
Proučavani su uvjeti koji su doveli do stvaranja novih vrhova.Kako bi se proučilo kako reakcijski uvjeti korišteni za proizvodnju umreženog HA hidrogela utječu na reaktivnost BDDE sredstva za umrežavanje, što dovodi do stvaranja novih vrhova (mogućih nusproizvoda), provedena su različita mjerenja.U ovim smo određivanjima proučavali i analizirali konačni BDDE umreživač, koji je tretiran s različitim koncentracijama NaOH (0%, 1%, 0,1% i 0,01%) u vodenom mediju, nakon čega je uslijedilo autoklaviranje ili bez njega.Bakterijski postupak za simulaciju istih uvjeta isti je kao i postupak korišten za proizvodnju umreženog HA hidrogela.Kao što je opisano u odjeljku "Materijali i metode", prijelaz mase uzorka analiziran je pomoću LC-MS na 203,30/129,10 Da.Izračunavaju se BDDE i koncentracija novog pika, a rezultati su prikazani u tablici 3. U uzorcima koji nisu bili autoklavirani nisu otkriveni novi pikovi, bez obzira na prisutnost NaOH u otopini (uzorci 1-4, tablica 3).Za autoklavirane uzorke, novi vrhovi se otkrivaju samo u prisutnosti NaOH u otopini, a čini se da formiranje vrha ovisi o koncentraciji NaOH u otopini (uzorci 5-8, Tablica 3) (RRT = 0,79).Slika 5 prikazuje primjer ionskog kromatograma, koji prikazuje dva autoklavirana uzorka u prisutnosti ili odsutnosti NAOH.
Kratice: BDDE, 1,4-butandiol diglicidil eter;LC-MS, tekućinska kromatografija i masena spektrometrija;MRM, praćenje višestrukih reakcija.
Napomena: Gornji kromatogram: Uzorak je tretiran s 0,1% vodenom otopinom NaOH i autoklaviran (120°C 20 minuta).Donji kromatogram: Uzorak nije tretiran s NaOH, već autoklaviran pod istim uvjetima.Konverzija mase od 203,30/129,10 Da (u pozitivnom MRM modu) analizirana je pomoću LC-MS.
Kratice: BDDE, 1,4-butandiol diglicidil eter;LC-MS, tekućinska kromatografija i masena spektrometrija;MRM, praćenje višestrukih reakcija.
U svim autoklaviranim uzorcima, sa ili bez NaOH, koncentracija BDDE bila je znatno smanjena (do 16,6 puta) (uzorci 5-8, Tablica 2).Smanjenje koncentracije BDDE može biti posljedica činjenice da na visokim temperaturama voda može djelovati kao baza (nukleofil) za otvaranje epoksidnog prstena BDDE i formiranje 1,2-diolnog spoja.Monoizotopska kvaliteta ovog spoja razlikuje se od kvalitete BDDE i stoga neće utjecati na nju.LC-MS je otkrio pomak mase od 203,30/129,10 Da.
Konačno, ovi eksperimenti pokazuju da stvaranje novih vršnih vrijednosti ovisi o prisutnosti BDDE, NAOH i procesu autoklaviranja, ali nema nikakve veze s HA.
Novi maksimum nađen u retencijskom vremenu od približno 2,71 minute karakteriziran je pomoću LC-MS.U tu svrhu, BDDE (9,9 mg/mL) je inkubiran u 1% vodenoj otopini NaOH i autoklaviran.U tablici 4, karakteristike novog vrha uspoređuju se s poznatim referentnim vrhom BDDE (vrijeme zadržavanja približno 3,47 minuta).Na temelju analize ionske fragmentacije dva pika, može se zaključiti da pik s vremenom zadržavanja od 2,72 minute pokazuje iste fragmente kao i BDDE pik, ali s različitim intenzitetom (Slika 6).Za vršnu vrijednost koja odgovara retencijskom vremenu (PIS) od 2,72 minute, primijećena je intenzivnija vršna vrijednost nakon fragmentacije pri masi od 147 Da.Pri koncentraciji BDDE (9,9 mg/mL) korištenoj u ovom određivanju, različiti modovi apsorbancije (UV, λ=200 nm) u ultraljubičastom spektru također su primijećeni nakon kromatografskog odvajanja (Slika 7).Vrh s vremenom zadržavanja od 2,71 minuta još je vidljiv na 200 nm, dok se vrh BDDE ne može uočiti u kromatogramu pod istim uvjetima.
Tablica 4. Rezultati karakterizacije novog pika s retencijskim vremenom od oko 2,71 minuta i BDDE pika s retencijskim vremenom od 3,47 minuta
Napomena: Kako bi se dobili ovi rezultati, LC-MS i HPLC analize (MRM i PIS) provedene su na dva pika.Za HPLC analizu koristi se UV detekcija s valnom duljinom od 200 nm.
Kratice: BDDE, 1,4-butandiol diglicidil eter;HPLC, tekućinska kromatografija visoke učinkovitosti;LC-MS, tekućinska kromatografija i masena spektrometrija;MRM, praćenje višestrukih reakcija;m/z, omjer mase i naboja;PIS, Ionsko skeniranje proizvoda;ultraljubičasto svjetlo, ultraljubičasto svjetlo.
Napomena: Fragmenti mase dobiveni su LC-MS analizom (PIS).Gornji kromatogram: maseni spektar fragmenata BDDE standardnog uzorka.Donji kromatogram: maseni spektar novog otkrivenog vrha (RRT povezan s vrhom BDDE je 0,79).BDDE je obrađen u 1% otopini NaOH i autoklaviran.
Kratice: BDDE, 1,4-butandiol diglicidil eter;LC-MS, tekućinska kromatografija i masena spektrometrija;MRM, praćenje višestrukih reakcija;PIS, ionsko skeniranje proizvoda;RRT, relativno vrijeme zadržavanja.
Slika 7 Ionski kromatogram 203,30 Da prekursora iona, i (A) novi pik s vremenom zadržavanja od 2,71 minuta i (B) UV detekcija BDDE referentnog standarda pika na 3,46 minuta na 200 nm.
U svim proizvedenim umreženim hidrogelovima HA, uočeno je da je koncentracija zaostalog BDDE nakon LC-MS kvantifikacije bila <2 ppm, ali se u analizi pojavio novi nepoznati vrh.Ovaj novi vrh ne odgovara BDDE standardnom proizvodu.BDDE standardni proizvod također je prošao istu analizu pretvorbe kvalitete (MRM pretvorba 203,30/129,10 Da) u pozitivnom MRM modu.Općenito, druge analitičke metode kao što je kromatografija koriste se kao granični testovi za otkrivanje BDDE u hidrogelovima, ali maksimalna granica detekcije (LOD) je nešto niža od 2 ppm.S druge strane, do sada su NMR i MS korišteni za karakterizaciju stupnja umreženosti i/ili modifikacije HA u fragmentima jedinica šećera umreženih proizvoda HA.Svrha ovih tehnika nikada nije bila kvantificirati detekciju rezidualnog BDDE pri tako niskim koncentracijama kao što opisujemo u ovom članku (LOD naše LC-MS metode = 10 ppb).
Vrijeme objave: 1. rujna 2021